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En 1961 Marshall Niremberg Junto con el grupo de Har Khorana fue el responsable del desciframiento del código genético. Consideraron como la más razonable la premisa de que un codón estaba formado por tres letras, lo que aportaba un número de 64 posibles combinaciones, suficientes para designar los 20 aminoácidos que intervienen en la síntesis de proteínas. Descartaron que un código de 4 letras porque según el principio de parsimonia -antiguamente denominado Navaja de Ockam- la solución más sencilla es a menudo la correcta.

Testaron esta hipótesis en el laboratorio. Lograron sintetizar, aprovechando los avances en este campo realizados por Severo Ochoa, diferentes cadenas de RNA sintético, cada de ellas compuesta de un único codón repetido muchas veces.

Después cada tipo de RNA sintético se añadió a un sistema de transcripción in vitro, es decir, a un extracto de E. Coli que supuestamente contenía los ribosomas, los RNAs transferentes, y los aminoácidos. Lo trataron con DNAsa para asegurarse de que no hubiese ningún ADN que pudiera interferir en el experimento y añadieron su ADN sintético. Tal como se esperaba, cada RNA sintético produjo una cadena de aminoácidos repetidos.

El primer ARN sintético que probaron estaba compuesto exclusivamente por uracilo. Añadieron el Poli-U RNA al extracto. Cuando, después de centrifugar el extracto, estudiaron los productos, encontraron polipéptidos compuesto exclusivamente por el aminoácido fenilalanina. Concluyeron que el codón UUU codificaba la fenilalanina. De ese modo continuaron probando las diferentes combinaciones (poli-C (prolina), poli-A (lisina), poli-G, hasta que lograron descifrar el significado de 50 tripletes.

Sin embargo, algunos codones resultaban especialmente difíciles de descifrar, porque no se podía establecer su orden bioquímicamente. Por ejemplo un triplete con dos Gs y una C podía tener este orden: CGG, GCG, o GGC. A partir de este momento se cambio la estrategia. Acababa de descubrirse la activación de RNAt, lo cual permitió descifrar los últimos tripletes del codigo.

El RNA transferente es una molécula que transporta aa a los ribosomas para la síntesis proteica. En 1962, Robert Holley resolvió la estructura del tRNA (figura 2). A pesar de que el tRNA es monocatenario, hay zonas de nucleótidos complementarios que se unen para formar regiones bicatenarias, las cuales curvan el RNA y le otorgan su estructura característica en hoja de trébol.

Holley demostró que todos los tRNA tienen la misma forma característica en forma de hoja de trébol. En una región de una de las hojas, una secuencia de tres nucleótidos forma el anticodón, el cual se empareja con el codón específico en la secuencia de mRNA. De ese modo existe una tRNA diferente para cada codón de mRNA.

Usando el sistema de traducción in vitro, Zamenick y su grupo demostraron que el tRNA se activa cuando el aminoácido se une al tallo del tRNA. Este paso requiere energía química en forma de ATP.

La clave estuvo en el desarrollo de un método que permitía separar el tRNA activado y de ese modo identificar el aminoácido que se le había unido.

Como dato curioso cabe señalar que Niremberg y Khorana no conocían las secuencias de sus RNAs sintéticos ya que aún no se habían desarrollado los métodos de secuenciación. Deducían la secuencia variando la cantidad de nucleótidos que añadían y calculando la probabilidad de que diese lugar a un codón determinado.